簡介
嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)由于其傳播速度快，已成為全球關注的問題。目前，通過細胞培養(yǎng)監(jiān)測和量化SARS-CoV-2感染的方法既耗時又費力。然而，法蘭克福大學創(chuàng)建的睡美人轉座子系統(tǒng)——一個強大且多功能的細胞感染模型，可使研究人員能夠低成本高效率地在體外高通量監(jiān)測SARS-CoV-2的復制。
本應用指南來自于法蘭克福大學于2021年7月發(fā)表在《微生物學前沿》上的一篇論文。該研究描述了使用SparkCyto開發(fā)細胞模型，實現(xiàn)針對SARS-CoV-2的高通量研究。
Spark Cyto全自動實時活細胞成像系統(tǒng)用于本次研究，它的成像模塊包含三個可選擇的物鏡和四個熒光通道。該儀器的照明和自動對焦系統(tǒng)都是基于LED，可以在微孔板中實現(xiàn)高質(zhì)量的明場成像。該研究還充分利用了Spark Cyto的高度靈活性，實現(xiàn)了在受控環(huán)境下長達198小時的活細胞成像，使用明場和紅色熒光通道監(jiān)測SARS-CoV-2復制誘導的細胞病變效應(CPEs)。
該系統(tǒng)的易用軟件 SparkControl™提供各種功能，包括調(diào)節(jié)溫度、CO2和蒸發(fā)保護等環(huán)境控制，以及動力學實驗的設置。這些功能支持復雜的細胞分析，包括細胞活力、凋亡、轉染效率和細胞死亡。在這些應用中，匯合度評估提供了一個有效的無標記替代方法來評估細胞的生長行為。在SparkControl的con uence應用程序中可以獲得粗糙度系數(shù)，它提供了一種簡單的細胞毒性、細胞分裂，甚至是微孔中的細胞被細菌或酵母污染水平的測量方法，而不需要進行熒光染色（圖1）。SparkControl將粗糙度系數(shù)計算為包含一個或多個細胞的所有分離區(qū)域的像素強度的歸一化平均標準偏差。無量綱化的粗糙度系數(shù)的值可以在零到無窮之間，并可以與專有的圖像分析軟件Image Analyzer™結合，提供對象遮罩的簡單優(yōu)化，以微調(diào)結果。
在細胞培養(yǎng)過程中研究細胞的各種特性，以構建和表征一個合適的細胞系。例如，選擇高轉染效率和對胰蛋白酶有良好反應是至關重要的。為此，我們用GFP編碼質(zhì)粒轉染細胞，利用綠色熒光計數(shù)功能來評估轉染效率。用胰蛋白酶處理融合細胞，DAPI染色計數(shù)法檢測細胞分離情況。結合其他特點，如對干擾素處理有適當?shù)姆磻罱K選擇細胞株A 5 4 9 來生成體外模型。然后對選定的細胞株進行SARS-CoV-2感染研究。
CPEs表明感染病毒引起的宿主細胞結構變化，是通過匯合度減少和粗糙度評估確定的。與匯合度的減少相比，由于SARS-CoV-2誘導的細胞形態(tài)改變，粗糙度系數(shù)有更大的增加。這是由于SARS-CoV-2糖蛋白介導的膜融合形成合胞體所致。
SARS-CoV-2的進入宿主細胞高度依賴于ACE2受體和TMPRSS2蛋白酶的表達。為了監(jiān)測這一點，A549-AT細胞中另外含有一個dTomato的序列作為ACE2組成性表達構建的一部分，允許用紅色熒光成像檢測SARS-CoV-2誘導的細胞溶解。該方法被用于確定單克隆中和抗體(mAbs)的有效性，證明該細胞系適合用于藥物篩選和病毒學分析。
結果
通過抗體介導的免疫熒光檢測病毒蛋白，證明所觀察到的匯合度變化、粗糙度增加和紅色熒光減少是由病毒特異性誘導的。
在SARS-CoV-2研究中，高通量細胞模型的主要前提是容易培養(yǎng)、良好的重現(xiàn)性和明顯的干擾素反應。在評估了不同細胞株對I-III型干擾素反應的敏感性后，初步選擇了兩種合適的候選細胞株A549和Caco2，并根據(jù)增殖率、胰蛋白酶消化和轉染效率進一步分析細胞培養(yǎng)特性。在Spark Cyto上使用自動匯合度測量和細胞計數(shù)功能，在16天的時間內(nèi)監(jiān)測細胞生長。人肺上皮細胞株A549在第8天達到完全匯合。此外，A549在分裂實驗前的分離時間明顯縮短，且轉染效率高于Caco2細胞。數(shù)據(jù)證實，A549細胞在高通量分析中表現(xiàn)出適合作為研究SARS-CoV-2感染的細胞模型的特征。
ACE2和TMPRSS2是SARS-CoV-2進入病毒細胞的必要受體，利用促芽孢桿菌素S脫氨酶（BSD）作為選擇標記，構建出有ACE2- dTomato表達的A549（圖3）。在EF1 α啟動子的控制下使用類似的構建，用藍色熒光蛋白(BFP)和濕霉素抗性基因單元(HygR)組成表達TMPRSS2。采用流式細胞術對不同表達水平的細胞進行分選。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)A549-ACE2高 / TMPRSS2低細胞(A549-AT)是SARS-CoV-2引起的CPE變化最明顯的細胞系。
用SARS-CoV-2菌株FFM1（2020年初從中國武漢的一名個體中分離）感染細胞，并進行RT-qPCR分析。檢測到可作為活性復制和病毒釋放的替代標記物的特定病毒mRNA，表明生產(chǎn)性感染也會導致細胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生感染性病毒。
使用Spark Cyto的自動細胞成像系統(tǒng)監(jiān)測非侵入性SARS-CoV-2復制。再次用SARS-CoV-2 FFM1毒株感染細胞，僅在感染后12小時觀察到CPE的形成和匯合度的減少（圖4）。由于合胞體的形成和細胞裂解，粗糙度系數(shù)增加。細胞粗糙度是估計CPE的一個很好的標記，因為它出現(xiàn)在匯合度變化之前。
A549 - AT 細胞用于顯示各種SARS-CoV-2分離株的CPE，包括Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)和Zeta (P.2)變異株，這些變異與更高的傳播或免疫逃避有關。除了匯合度減少和粗糙度系數(shù)增加外，病毒感染時dTomato信號的丟失是監(jiān)測CPE形成的另一種節(jié)約時間和資源的高效讀取方法。
所有這些數(shù)據(jù)表明A549-AT模型細胞株適用于各種自動化讀取方法來確定SARS-CoV-2的復制。接著對構建的細胞株進行了評價和測試以確定其在藥物篩選中的可用性，包括抗病毒藥物和單克隆抗體篩選。首先用瑞德西韋和卡莫司他處理細胞，這導致了病毒復制的顯著減少（數(shù)據(jù)見參考文獻原文圖6）。由于單克隆抗體和患者源血清的中和滴度是影響SARS-CoV-2免疫的重要因素，因此采用A549-AT細胞進行相互抗體滴度測定。商業(yè)單抗bamlanivimab (LY-CoV555)可以有效地中和SARS-CoV-2變異株B.1.1.7以及2020年初的分離株B。通過測量細胞匯合度和粗糙度系數(shù)，以及dTomato表達的熒光測量—稱為相對熒光強度(RFI)——可以觀察到中和抗體對CPE形成的濃度依賴性效應。然而，對B.1.351或P.2變異株均不存在中和效應（圖5）。這些數(shù)據(jù)表明，自動化評估中和抗體的效力是可行的。
結論
自動化無創(chuàng)光學讀取方法，包括對匯合度和粗糙度系數(shù)的評估，以及dTomato的熒光測量。此外，本文還進行了活細胞成像和長期動力學研究。Spark Cyto的高靈活性非常適合于自動化，可對SARS-CoV-2感染進行高通量、低成本的研究。綜上所述，A549-AT細胞適合作為SARS-CoV-2感染研究中的高通量模型細胞株。這些數(shù)據(jù)進一步強調(diào)了該細胞株可用于篩選抗病毒化合物， 以及研究針對不同SARS-CoV-2變種的中和抗體的有效性。
參考文獻
Widera, M et al. Generation of a Sleeping BeautyTransposon-Based Cellular System for Rapidand Sensitive Screening for Compounds andCellular Factors Limiting SARS-CoV-2 Replication.Front Microbiol, 2021, 12 , July. doi: 10.3389/fmicb.2021.701198.
Toptan, T et al. Optimized qRT-PCR approach forthe detection of intra- and extra-cellular SARS-CoV-2RNAs. INT J MOL SCI, 2020, 21 (12), 4396. doi.org/10.3390/ijms21124396.
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654352961670008832） | 
