簡介
鈣離子（Ca2+）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的第二信使，參與基因表達(dá)、增殖、分化和細(xì)胞死亡等關(guān)鍵細(xì)胞過程。Ca2+濃度在細(xì)胞外（1.5 mM）和細(xì)胞內(nèi)（胞漿內(nèi)100 nM）以及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異。細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放存儲(chǔ)在細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，會(huì)使胞漿內(nèi)Ca2+濃度增加，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路。質(zhì)膜上還有幾個(gè)離子通道控制Ca2+從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，例如電壓門控鈣通道（VGCCs）。
細(xì)胞內(nèi)異常的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)和Ca2+紊亂與多種疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和各種癌癥。此外，鈣離子通道的高水平表達(dá)與治療性抗拒、干細(xì)胞狀態(tài)、自我更新和癌細(xì)胞的遷移能力有關(guān)。幾種常見的化療藥物會(huì)干擾癌細(xì)胞中的Ca2+穩(wěn)定性和Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)。因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的監(jiān)測是一種有用且應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)方法。
Fluo-4是一種經(jīng)典熒光染料用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)Ca2+，其與Ca2+結(jié)合后綠色熒光增強(qiáng)。將溶解好的Fluo-4直接添加到含有培養(yǎng)細(xì)胞的微孔板中，細(xì)胞可以載入乙酰氧基甲酯（AM）形式的Fluo-4，然后可以通過標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測或基于熒光的細(xì)胞成像檢測Fluo-4。
在Spark Cyto上可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)這兩種功能。該系統(tǒng)是第一臺(tái)活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像酶標(biāo)儀，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的半自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程。它將多功能檢測模塊和熒光成像相結(jié)合，可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行可視化和功能檢測。
Spark Cyto配備了高端成像模塊，包括三個(gè)可選的物鏡、四個(gè)熒光通道、一個(gè)LED照明和高度可靠、快速自動(dòng)的聚焦系統(tǒng)。通過用戶友好和直觀的SparkControl™軟件，Spark Cyto可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)分析的自動(dòng)化，如全環(huán)境控制、動(dòng)力學(xué)軟件和動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)能力，為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一套簡單的解決方案。
本文描述了一種使用Spark Cyto多色熒光成像和ImageAnalyzer™軟件分析胞內(nèi)Ca2+濃度和Ca2+攝取的半高通量方法。通過鈣離子載體-離子霉素處理增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，用Fluo-4結(jié)合使用細(xì)胞核染料Hoechst 33342進(jìn)行定量檢測。
材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)
KKU-055細(xì)胞（人膽管癌細(xì)胞系；JCRB）在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下（37°C，5%CO2），在DMEM培養(yǎng)基（Gibco）中，生長至約80%匯合度。DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，Biochrom），1%抗生素-抗真菌溶液（ABAM，Merck），1mM丙酮酸鈉（Merck），以及10mM HEPES（Merck）。
試劑
將Hoechst 33342溶液（20 mM，ThermoFisherScienti?c）、Fluo-4、AM（ThermoFisher Scienti?c，溶解于DMSO中至1 mM的濃度） 和離子霉素（Merck，溶解于DMSO中至1 mM的濃度）分裝，并在-20°C下儲(chǔ)存。
染色和離子霉素處理
用胰蛋白酶/EDTA（Merck）處理收集細(xì)胞，并以每孔7500個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板（Tecan）中，過夜培養(yǎng)。用無血清的DMEM（sfDMEM）清洗細(xì)胞一次，加入Hoechst 33342（1μM）和Fluo-4（0.5μM），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10分鐘。在培養(yǎng)孔中添加離子霉素（1μM）后立即開始檢測。
儀器
Spark Cyto 600
檢測方案和分析
熒光成像（藍(lán)色通道檢測Hoechst細(xì)胞核染料，綠色通道檢測Fluo-4陽性細(xì)胞）通過動(dòng)力學(xué)循環(huán)（5個(gè)周期，每個(gè)周期2分鐘）檢測胞內(nèi)Ca2+的時(shí)間依賴性變化。為了分析單細(xì)胞水平的胞內(nèi)Ca2+，并驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案的動(dòng)態(tài)適用性，動(dòng)力學(xué)循環(huán)設(shè)置一個(gè)條件（每孔計(jì)數(shù)5000個(gè)帶綠色熒光的細(xì)胞）。使用Image分析軟件的Voronoi分析功能分析雙陽性細(xì)胞，并確保單細(xì)胞水平的可靠測量。為了評(píng)估Voronoi分析的特異性，同時(shí)使用了多色熒光成像儀的分析功能，兩者選用相同的分析選項(xiàng)設(shè)置。有關(guān)詳細(xì)設(shè)置，請參見圖1。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
所有數(shù)據(jù)點(diǎn)代表7次重復(fù)的平均值，±標(biāo)準(zhǔn)平均誤差（SEM）。使用OriginPro®2019b（OriginLab）進(jìn)行計(jì)算。
結(jié)果和討論
使用動(dòng)力學(xué)循環(huán)功能，可以可靠地監(jiān)測離子霉素處理后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，并為隨后在單細(xì)胞水平上分析細(xì)胞內(nèi)Ca2+定義了一個(gè)條件（5000個(gè)綠色熒光的細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2所示。
為了在細(xì)胞水平上檢測鈣流的大小，把多色熒光成像與Voronoi分析相結(jié)合。同時(shí)檢測藍(lán)色和綠色的雙陽性細(xì)胞，代表胞內(nèi)鈣流增加。此外，為了檢測Voronoi分析的特異性，對(duì)常規(guī)（非Voronoi）分析進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。
正如預(yù)期的那樣，分析模式（Voronoi與非Voronoi）對(duì)與核染色相關(guān)的結(jié)果沒有影響（圖3）。然而，與非voronoi相比，Voronoi分析導(dǎo)致了“帶綠色信號(hào)的藍(lán)色目標(biāo)計(jì)數(shù)”（即雙染色細(xì)胞，見圖4）的值相對(duì)更低。如圖5所示，這種現(xiàn)象是由于Voronoi分析的特定算法，從而減少了假陽性。非Voronoi分析會(huì)產(chǎn)生重疊計(jì)數(shù)事件，因此會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)（圖5，上），而使用Voronoi分析可以更精確地解決這些重疊計(jì)數(shù)事件（圖5，下）。
結(jié)論
將多色熒光成像與Voronoi分析相結(jié)合是實(shí)時(shí)測量細(xì)胞水平鈣離子變化的可靠工具。此外，結(jié)合Ca2+敏感染料和核染色可以在細(xì)胞水平上分析細(xì)胞內(nèi)Ca2+。在這個(gè)設(shè)置中，Voronoi分析優(yōu)于非Voronoi分析，因?yàn)樗钚』思訇栃越Y(jié)果。這里提供的方案是可擴(kuò)展的，適用于半高通量的應(yīng)用。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654332953925570560） | 
