簡(jiǎn)介
監(jiān)測(cè)原核細(xì)胞和酵母的生長(zhǎng)是生命科學(xué)以及食品工業(yè)中的重要研究工具。比濁法是一種對(duì)細(xì)菌和酵母菌進(jìn)行定量測(cè)量的成熟方法。該技術(shù)基于這樣一個(gè)事實(shí)，即溶液的濁度與其所含的微生物數(shù)量成正比，并且隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而增加。使用分光光度計(jì)則可以輕松測(cè)量濁度，通過樣品的光會(huì)被微生物散射。細(xì)胞中含有許多吸收光的大分子，例如 260 nm的DNA、280 nm的蛋白質(zhì)、400至500 nm之間的細(xì)胞色素和其他各細(xì)胞色素。當(dāng)通過光散射測(cè)量細(xì)菌和酵母菌時(shí)，最好選擇吸收率最低的波長(zhǎng)；建議波長(zhǎng)為600nm，而且它適用于大多數(shù)的培養(yǎng)物。在此波長(zhǎng)下，樣品的光密度（OD）與存在的細(xì)胞數(shù)量直接成正比，因此此方法便可以作為跟蹤細(xì)胞生長(zhǎng)的一種方法。只有通過生成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能夠?qū)崿F(xiàn)于 600 nm 處的吸光度精確測(cè)量從而得到細(xì)胞數(shù)量。
Tecan的新一代多功能酶標(biāo)儀Spark和Spark Cyto，以及Tecan產(chǎn)品組合中的其他酶標(biāo)儀（如Infinite® 200 PRO系列）已成功地應(yīng)用于分析細(xì)菌和酵母生長(zhǎng)的各種研究。顯然，使用微孔板而不是比色皿來監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的最顯著的益處是更高的通量。高端酶標(biāo)儀的其他優(yōu)點(diǎn)是：具備微孔板振蕩功能以、溫度控制及培養(yǎng)功能，且堅(jiān)固耐用。這就意味著不需要把微孔板從培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到分光光度計(jì)，從而可以在酶標(biāo)儀內(nèi)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)力學(xué)研究，而無需手動(dòng)中斷，并自動(dòng)地消除了結(jié)果數(shù)據(jù)圖中的過夜間隙。
此外，Spark酶標(biāo)儀還為細(xì)菌生長(zhǎng)研究提供了有價(jià)值的特色功能，例如集成的微孔板架Lid Lifter™，最大程度地減少介質(zhì)揮發(fā)的濕度匣，用于將溫度精確控制在18至42°C區(qū)間內(nèi)的Te-Cool™冷卻模塊，以及用于實(shí)現(xiàn)4倍物鏡明場(chǎng)成像的成像模塊。
Spark Cyto在很大程度上結(jié)合了與Spark相同的功能（Te-Cool™兼容性除外），并具有先進(jìn)成像模塊的附加優(yōu)勢(shì)，可提供三種不同分辨率的明場(chǎng)和熒光成像功能。
本技術(shù)說明展示了 Spark 酶標(biāo)儀適用于在常用的24孔板和96孔]板上為三種不同的細(xì)菌菌株生成生長(zhǎng)曲線：
大腸桿菌 (E. coli) 是大腸桿菌屬的一種革蘭氏陰性、兼性厭氧、桿狀、大腸菌群、鞭毛狀細(xì)菌，常見于熱血生物的下腸。多數(shù)大腸桿菌菌株是無害的，但是具有腸致病性(EPEC)、腸毒素原性(ETEC)等類型可在其宿主體內(nèi)引起嚴(yán)重的食物中毒，偶爾見于食品污染事件。大腸桿菌是生命科學(xué)和生物技術(shù)研究開發(fā)中最重要的菌種。
英諾克李斯特菌，又稱無害李斯特菌 (L. innocua) 是一種革蘭氏陽性的桿狀細(xì)菌。它是可移動(dòng)的，兼性厭氧的，非孢子形成的。英諾克李斯特菌之所以被命名為英諾克（無害），是因?yàn)橄鄬?duì)于單增李斯特菌，它在哺乳動(dòng)物中并不容易引起疾病。英諾克李斯特菌通常被用作單增李斯特菌的替代品。
頭葡萄球菌 (S. capitis) 是葡萄球菌屬的一種凝固酶為陰性的細(xì)菌。它是人類頭皮、臉部、頸部、陰囊和耳朵皮膚正常菌群的一部分，與人工瓣膜心內(nèi)膜炎有關(guān)，但很少與自然瓣膜感染有關(guān)。頭葡萄球菌通常用作金黃色葡萄球菌的替代品。
文章描述了上述三種細(xì)菌菌株在24孔和96孔板中，8小時(shí)內(nèi)生成OD 600生長(zhǎng)曲線的既定方法。重要儀器設(shè)置（如振蕩）帶來的影響，也需要考慮進(jìn)來。
材料和方法
• Spark多功能酶標(biāo)儀
• 大腸桿菌（ATCC 25922）， 肉蛋白胨培養(yǎng)基 （MPM）
• 英諾克李斯特菌（ATCC 33090）， 腦心浸液 （BHI）
• 頭葡萄球菌 （ATCC 27840），胰蛋白酶大豆酵母提取物（TSYE）
• Greiner® Cellstar 24孔及96孔板，平底、透明 (24孔板#662102，96孔板#655185
細(xì)菌菌株在20 ml推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行有氧環(huán)境下的培養(yǎng)。在MaxQ™ 4450臺(tái)式軌道振蕩器（Thermo Fisher）上以37 °C / 分鐘200轉(zhuǎn)速孵育過夜后，將液體懸浮液稀釋至600 nm處約0.05 OD的吸光度。為了使程序標(biāo)準(zhǔn)化，為24孔及96孔板分別選擇了最大工作體積：96孔板為200微升、24孔板為1200 μl。這樣使得所有細(xì)菌細(xì)胞獲取到最多的培養(yǎng)基成分，以及取得最佳的混勻效果。此外，使用最大工作體積可在指定的微孔板中實(shí)現(xiàn)最長(zhǎng)的吸光度測(cè)量路徑長(zhǎng)度，從而提高 OD 600 測(cè)量的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。 此外，還以最大單孔容積的50%（即600 μl /孔）估算了24孔板。
使用Para?lm為微孔板加蓋，并將蓋子固定在微孔板上；另一種方法是使用微孔板密封膜。若使用微孔板密封膜固定蓋子，微孔板振蕩期間將導(dǎo)致塑料磨損，這可能會(huì)對(duì)信號(hào)檢測(cè)和細(xì)胞增殖造成干擾。然后將微孔板在Spark多模酶標(biāo)儀中孵育8小時(shí)，使用以下所列的模式和參數(shù)進(jìn)行連續(xù)振蕩和溫度控制：
初步測(cè)試顯示，只有在軌道振蕩模式下才能產(chǎn)生可接受的生長(zhǎng)曲線（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，考慮到可能會(huì)產(chǎn)生可接受的生長(zhǎng)曲線，對(duì)其他微生物使用線性和雙軌道振蕩模式的做法不應(yīng)被排除。
結(jié)果及討論
圖1至3顯示了96孔板中三種細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)曲線。1mm的振蕩幅度提供了最可行的振蕩頻率，是適用于三種細(xì)菌菌株的最佳設(shè)置。對(duì)于大腸桿菌，1 mm的振蕩幅度對(duì)于取得可觀的細(xì)菌生長(zhǎng)至關(guān)重要（圖1）。
對(duì)于頭葡萄球菌（圖2）和英諾克李斯特菌（圖3），效果雖沒有那么顯著但仍然可見當(dāng)使用 3 mm 和 6 mm 振蕩幅度時(shí)，生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)顯著不同。當(dāng)考慮這些不同細(xì)菌菌株的形狀和形態(tài)時(shí)，很明顯，大腸桿菌作為一種鞭毛狀細(xì)菌，需要使用最大的振蕩強(qiáng)度以避免在孵育過程中的細(xì)菌聚集現(xiàn)象。只有使用Spark酶標(biāo)儀提供的最低振動(dòng)幅度才能實(shí)現(xiàn)。
從圖4可以看出，以最大培養(yǎng)基容積培養(yǎng)的 24 孔板的振蕩幅度及相應(yīng)結(jié)果。通常，3 mm 和 6 mm 的較大振蕩幅度會(huì)產(chǎn)生更高質(zhì)量的生長(zhǎng)曲線。使用 3 mm 和 6 mm 振蕩幅度的樣品在接種后僅 1 小時(shí)便開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，并在 5 小時(shí)后到達(dá)平臺(tái)期；而振蕩幅度為 1 mm 的樣品生長(zhǎng)曲線延遲上揚(yáng)，并在大約 8 小時(shí)后才能到達(dá)平臺(tái)期?？傮w而言，24 孔板上振蕩幅度帶來的影響不如具有較小孔徑的 96 孔板顯著。
在24孔板中最大工作體積為 1200 μl 的培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線結(jié)果偶爾會(huì)因樣品液體溢出到微孔板蓋上而受到影響。為避免這種情況，我們建議最大工作體積不要用于6至 48 孔板。通過使用 600 μl 培養(yǎng)基在 24 孔板中生成的生長(zhǎng)曲線來測(cè)試較小工作體積帶來的影響，例如最大工作體積的 50%（如圖5所示）。同樣地，與 1 mm 振蕩幅度相比，3mm 和 6 mm 振蕩幅度也能產(chǎn)生更好的生長(zhǎng)曲線。然而，與1200 μl 培養(yǎng)基對(duì)比，生長(zhǎng)曲線似乎與振蕩幅度相關(guān)性較小，如先前觀察到的 1 mm 振幅下的延遲生長(zhǎng)（如圖4所示）較不顯著（如圖5所示）。
降低微孔板的孔中樣品體積時(shí)的另一個(gè)考慮因素是，OD 600 吸光度測(cè)量的光程長(zhǎng)度也減小，從而導(dǎo)致整體上最大 OD 值降低、動(dòng)態(tài)測(cè)量范圍減小。從圖6中能夠很清楚地看出這種效應(yīng)，該圖顯示了分別處于 600 μl 和 1200 μl 體積的 24 孔板中培育的大腸桿菌生長(zhǎng)情況。有趣的是，雖然將體系體積降低到 600 μl 會(huì)導(dǎo)致動(dòng)態(tài)測(cè)量范圍減小，但它使得培育動(dòng)態(tài)得到改善，相比 1200 μl 體積的細(xì)胞，其生長(zhǎng)速率約提前1小時(shí)達(dá)到停滯狀態(tài)。這可以通過大腸桿菌的形態(tài)來解釋：較少的體積可以在 24 孔板中得到更好的混合，從而增強(qiáng)培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)。
這些結(jié)果表明：細(xì)菌生長(zhǎng)取決于許多不同的因素，包括細(xì)菌菌株、微孔板的類型和形式、培養(yǎng)基反應(yīng)體積以及至關(guān)重要的儀器參數(shù)設(shè)置（例如振蕩模式和其振幅）。
總結(jié)
監(jiān)測(cè)細(xì)菌和酵母的生長(zhǎng)是生命科學(xué)和食品工業(yè)中重要的研究工具。Tecan的產(chǎn)品，尤其是其酶標(biāo)儀，在該研究領(lǐng)域久經(jīng)考驗(yàn)，并提供創(chuàng)新的功能來支持客戶的多樣化需求。本技術(shù)說明展示了Spark多模式酶標(biāo)儀在為大腸桿菌 (E.coli)、英諾克李斯特菌 (L. innocua)、及頭葡萄球菌 (S.capitis)在24孔板及96孔板上生成生長(zhǎng)曲線的出色性能。此外，這項(xiàng)研究清晰地強(qiáng)調(diào)了初步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的重要性，數(shù)據(jù)質(zhì)量主要取決于振蕩幅度參數(shù)。
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654682525225381888） | 
