簡介
細胞遷移是多細胞生物發(fā)育和維持的核心過程，胚胎發(fā)育過程中的組織形成、傷口愈合和免疫反應都需要細胞的協(xié)調(diào)運動和組裝。細胞遷移過程中出現(xiàn)的異常情況與各種疾病有關——包括癌癥、動脈粥樣硬化和關節(jié)炎——因此，了解細胞遷移和觸發(fā)細胞從一個位置遷移到另一個位置的生物事件是研究的重點。
在這種情況下，基于成像的分析方法是研究細胞遷移的非常有價值的工具。雖然使用視覺顯微鏡進行圖像分析是細胞生物學中一種長期可靠的方法，但它非常耗時和費力。細胞樣本的自動成像分析極大地改善了實驗工作流程并提高了通量，同時最大限度地減少了由可變起始條件引起的實驗間差異?；趯崟r成像的讀數(shù)可用于在不間斷長時間u對細胞生長和健康進行無人值守監(jiān)測。
Tecan 的 Spark 儀器平臺具有集成的明場細胞成像模塊，可實現(xiàn)對微孔板孔中細胞匯合度的無標記實時評估。酶標儀能夠檢測 6 至 96 孔板的細胞覆蓋區(qū)域，并根據(jù)分析區(qū)域計算相對匯合率。匯合率還可用于將其他細胞相關信號（例如細胞 ATP 含量）標準化為樣本中的細胞數(shù)量。 Spark的匯合成像功能允許研究各種不同形式的細胞遷移——例如趨化性、遷移和組織侵襲，以及腫瘤細胞轉移。
Radius™ 96 孔細胞遷移檢測是一種所謂的“間隙閉合”檢測系統(tǒng)，它使用定義的無細胞區(qū)域，可以重新填充細胞并通過視覺或自動顯微鏡進行實時監(jiān)測。
與只能在終點進行分析的 Boyden 室檢測不同，Radius檢測使用專有的細胞培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板帶有一個由生物相容性水凝膠（Radius 凝膠）在每個板孔的中心。當細胞在孔中接種時，它們會附著在除凝膠點之外的任何地方，從而產(chǎn)生無細胞區(qū)。細胞播種后，凝膠點被去除，允許遷移細胞穿過該區(qū)域并關閉間隙。細胞單層中的這種“人造傷口”可用于研究細胞遷移、細胞增殖和傷口閉合。由于間隙在板孔內(nèi)有明確區(qū)域和位置，使得這種方法比傳統(tǒng)的劃痕檢測顯示更一致。
本文使用 Radius 96 孔細胞遷移分析試劑盒描述了 Spark多功能酶標儀的成像功能監(jiān)測細胞遷移的應用。
此外，本文說明了細胞匯合度和細胞內(nèi) ATP 含量之間的相關性，作為細胞活力和新陳代謝的指標。
材料和方法
遷移
Radius 96 孔細胞遷移分析試劑盒（Cell Biolabs，CBA-126）與 Spark 多功能酶標儀的匯合成像功能結合，監(jiān)測兩種膽道癌細胞系（“CL1”和“CL2”） 30 小時內(nèi)細胞遷移和增殖。CL1 具有可忽略的遷移特性，而 CL2 具有高遷移活性。將細胞在補充有L-谷氨酰胺(L-glutamine)、青霉素(penicillin)/鏈霉素(streptomycin)、丙酮酸鈉(sodiumpyruvate) 和 HEPES + 10% 胎牛血清 (FCS) 的 DMEM 高葡萄糖中培養(yǎng)。對于遷移實驗，將細胞轉移到不含 FCS 的培養(yǎng)基中以最大限度地減少細胞分裂，并且能夠監(jiān)測遷移活動。然后將細胞以 3x104 個細胞/孔的初始密度（預先確定最佳接種密度）接種到透明的 Radius 96 孔細胞遷移分析微孔板（隨試劑盒提供）中，并培養(yǎng)過夜。在實驗開始時移除Radius 板的插入物，并在 30 小時內(nèi)監(jiān)測遷移細胞對無細胞區(qū)域的再增殖情況。
在Spark上檢測遷移以兩種方式進行：手動和自動/動力學設置。
1.手動：實驗期間將96板保存在傳統(tǒng)的 CO2 培養(yǎng)箱中，并在 0、2、4、6、8、24 和 30 小時時轉移到儀器中進行讀數(shù)。
2.自動化：整個測量在 Spark 酶標儀內(nèi)進行，在整個測量期間能夠保持 5% CO2 和 37 °C，使用儀器的環(huán)境控制功能創(chuàng)建自動化工作流程。
在手動設置中，每次測量均在終點模式而不是動力學模式下進行。對于自動化/動力學設置，在 30 小時的整個實驗期間記錄匯合度，每 30 分鐘有一個測量點。表 1 總結了自動/動力學細胞遷移實驗的測量設置。匯合模式設置為“中央”，這意味著從每個板孔的中心拍攝并分析了一張中央圖片。重要的是，“中央”模式僅在感興趣區(qū)域（即無細胞點）位于孔的中間時才有用。測量/成像區(qū)域不能在孔內(nèi)重新定位，檢測到的匯合值僅反映分析點中細胞覆蓋區(qū)域的百分比。然后根據(jù)圖片計算的匯合值作為細胞遷移的反比指標進行評估，假設初始 (0h) 值代表 100% 無細胞區(qū)域。
匯合與細胞 ATP 含量的相關性
使用 CellTiter-Glo® 發(fā)光細胞活力試劑盒(Promega,G7571) 檢測和量化細胞中的 ATP 水平。該方法是一種基于ATP 水平定量確定培養(yǎng)物中活細胞數(shù)量的均質(zhì)方法，作為樣品中存在代謝活性活細胞的指標 [2]。
同樣，使用兩種膽道癌細胞系（“CL3”和“CL4”）并以每孔初始細胞數(shù)范圍（25000、12500、6750、3125）接種到 96 孔板中和 1563 個細胞/孔）。 24、30、48 和 50 小時后，使用“全孔”模式測量每個孔中的匯合度，然后立即在相同孔中進行 ATP 定量測定。通過計算發(fā)光/匯合比來評估結果，并根據(jù) Grubbs 異常值檢測測試識別和去除異常值。
結果
遷移模式
使用 Spark 酶標儀的匯合功能可以清楚地看到兩種不同細胞系的預期遷移模式（圖1）。雖然 CL1 沒有或只有微不足道的遷移，但 CL2 在分析期間表現(xiàn)出無細胞區(qū)域的連續(xù)遷移和再增殖。
雖然在整個分析期間的遷移行為顯示了手動和自動處理的相似動態(tài)，但后者的優(yōu)點是不會由于操作人員的非工作時間而丟失數(shù)據(jù)點。因此，自動化處理提供了對細胞遷移動態(tài)一致且無間隙的分析。
在圖 2 中可以清楚地看到無細胞區(qū)域的持續(xù)重新填充，并記錄了填充的過程。在 30 小時分析期間，可以觀察到超過一半的初始無細胞區(qū)域的再增殖，無細胞區(qū)域隨著細胞遷移到圓圈中的增加而逐漸變小。在圖 1 和圖 2 中，假設初始值 (0 h) 代表 100% 無細胞區(qū)域。所有其他值均與初始情況相比較（另見表 2）。
通過 Spark Control™ 軟件在選定測量區(qū)域檢測到的逆匯合值來確定遷移程度，即孔中心的單張圖片（圖2）。為了準確確定間隙區(qū)域，推薦使用 ImageJ等第三方圖像分析軟件。
匯合度與細胞 ATP 含量的相關性
圖3 顯示了在細胞接種時使用不同的接種細胞數(shù)在 54小時內(nèi)的匯合度和ATP生物發(fā)光之間的相關性。隨著時間的推移，兩種信號都表現(xiàn)出相似的動態(tài)，表明細胞的逐漸生長，其特征在于細胞 ATP 含量的增加和孔底細胞密度的增加。接種細胞數(shù)低于 3000 個細胞/孔時，匯合度超出推薦范圍（<10%），因此建議使用更高的細胞數(shù)進行可靠的實驗。當接種細胞數(shù)量高于3125 個/孔，可以觀察到 ATP 信號和匯合度之間的良好相關性，表明可以使用匯合測量來標準化接種細胞數(shù)，而不需要額外通過檢測 ATP 含量來確定細胞數(shù)。
結論
這項研究的結果表明，Spark 酶標儀平臺非常適合檢測細胞遷移和匯合度測定，例如 Radius 96 孔細胞遷移測定。該儀器基于明場成像的匯合功能，能夠對細胞運動進行高質(zhì)量和無標記的實時監(jiān)測，從而量化和跟蹤細胞遷移的動態(tài)。酶標儀的 SparkControl 軟件可以輕松量化微孔板孔中的細胞匯合度，用戶可進行模式選擇，用于分析孔內(nèi)的不同區(qū)域并自動檢測任何類型微孔板的孔邊界。
該平臺擁有將匯合度與細胞 ATP 含量相關聯(lián)的能力，通過無人值守的自動化實驗，進一步簡化了基于細胞的分析工作流程。由于匯合度檢測是非標記定量技術，并且不會干擾任何其他細胞特性或性質(zhì)，因此，它可以在整個實驗期間連續(xù)進行，為更傳統(tǒng)、昂貴且費時費力的技術提供了一種簡單可靠的替代方法，非常適用于確定目標細胞群體的大小或質(zhì)量。
參考文獻
[1] Radius 96-Well Cell Migration Assay, Product Manual,CBA-126, Cell Biolabs Inc., San Diego, USA
[2]CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay,Technical Bulletin 288, 03/15, Promega, Madison,WI, USA
（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654764549508362240）
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