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| Western Blot一做就是一天半，有個(gè)方法幫你 3 小時(shí)搞定 |
| [ 發(fā)布日期：2023-5-8 13:36:16 閱讀次數(shù)：574 ] |
Western Blot（WB）被稱為科研人心中的「噩夢(mèng)」實(shí)驗(yàn)，為什么這么說(shuō)呢？首先，WB操作步驟繁雜，實(shí)驗(yàn)流程長(zhǎng)。從蛋白提取、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育到成像，每個(gè)流程都相當(dāng)耗時(shí)。特別是抗體孵育，還需要過(guò)夜。其次，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果受太多人為因素的影響。比如，制膠拔梳子太快，膠被弄裂；轉(zhuǎn)膜「三明治」疊放順序出錯(cuò)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜失敗......最讓人煩惱的一點(diǎn)，WB實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性不佳。學(xué)術(shù)新聞里常常能看到SCI 文章由于WB實(shí)驗(yàn)無(wú)法重復(fù)而撤稿。望著我的實(shí)驗(yàn)記錄本，滿滿的失敗數(shù)據(jù)和注意事項(xiàng)。眼看著離心管里來(lái)之不易的蛋白樣本就要見底，難道真的沒有更簡(jiǎn)單更可靠的WB實(shí)驗(yàn)方法了嗎？科研人員為了簡(jiǎn)化WB實(shí)驗(yàn)的流程，一直在對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。近年，興起了一種新的蛋白檢測(cè)技術(shù)--全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)定量分析（Automatic Quantitative Protein Analysis）。它將傳統(tǒng) WB 的制膠、蛋白電泳分離、雜交和成像集成到一個(gè)系統(tǒng)中，并實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。它因?yàn)椴襟E簡(jiǎn)單，也被叫做全自動(dòng)毛細(xì)管Digital Western系統(tǒng)（也稱Simple Western）。Digital Western一經(jīng)問世，便深受科研人的喜愛，它不光節(jié)省樣本，而且大大節(jié)省了操作時(shí)間，它精確的數(shù)據(jù)分析能力幫助科研人得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。頂級(jí)雜志Neuron（五年平均 IF = 18.65）2019 年發(fā)表的一篇文章中, Digital Western被用于微量中腦組織和原代神經(jīng)元細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)分析。作者僅用了 0.2μg總蛋白就得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這只是傳統(tǒng)WB所需蛋白量的幾十分之一。Nature Communications（五年平均IF = 15.81）發(fā)表了一篇有關(guān)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路研究的論文，也用了Digital Western 系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)蛋白。在該系統(tǒng)中，所用抗體在正確的波段顯示后才被正式使用到實(shí)驗(yàn)里。通過(guò)該系統(tǒng)自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)者對(duì)蛋白進(jìn)行了有效定量，確定了每個(gè)樣本中目標(biāo)蛋白的絕對(duì)值，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可信，更精準(zhǔn)。圖片來(lái)源：Nature Communications這些證據(jù)也許還不足以證明Digital Western的優(yōu)勢(shì)，我們不免還是抱有懷疑：Digital Western真的有這么厲害嗎？為此，有研究人員專門對(duì)比了Digital Western 系統(tǒng)和傳統(tǒng) WB 兩種蛋白定量分析方法的靈敏度、重復(fù)性和適用范圍[3]。結(jié)果表明相比于傳統(tǒng) WB ：? Digital Western 無(wú)需制膠、無(wú)需轉(zhuǎn)膜，安全環(huán)保? 3 小時(shí)左右獲得結(jié)果，縮短實(shí)驗(yàn)優(yōu)化時(shí)間? 全自動(dòng)化，無(wú)需值守，效率更高，可進(jìn)行多重檢測(cè)? 可以檢測(cè)低至 0.5 μg 左右的蛋白量，對(duì)于來(lái)源不易的樣本，更節(jié)省樣品? 實(shí)驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化，具有可重復(fù)性當(dāng)目標(biāo)蛋白分子量差異較大時(shí)，可以用Digital Western系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)目標(biāo)分子和內(nèi)參。圖注：采用Digital Western同時(shí)檢測(cè)兩種蛋白。(A) 同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參（GAPDH 或 Actin）和目的蛋白Ku70的泳道圖；(B) 同時(shí)檢測(cè)GAPDH和目的蛋白 Ku70 的峰形圖；(C) 同時(shí)檢測(cè)Actin和目的蛋白Ku70的峰形圖。其實(shí)，國(guó)內(nèi)外目前已經(jīng)有許多高分文獻(xiàn)應(yīng)用 Digital Western 技術(shù)檢測(cè)蛋白，WB 正在經(jīng)歷著前所未有的技術(shù)革新。StellarTM 超靈敏熒光檢測(cè)試劑盒，搭載在全自動(dòng)多功能超靈敏熒光Western蛋白質(zhì)分析平臺(tái)Jess上（Digital Western），能為科研人提供自動(dòng)化高靈敏熒光免疫蛋白檢測(cè)技術(shù)解決方案。優(yōu)勢(shì)如下：圖注：ProteinSimple超靈敏熒光檢測(cè)試劑盒 StellarTM? 多通道，可以在同一個(gè)泳道對(duì)不同蛋白多重檢測(cè)；圖注：Stellar NIR和IR熒光多重檢測(cè)的AKT總/磷蛋白。StellarTM NIR / IR通道能夠在同一泳道中多重檢測(cè)總AKT和磷酸化AKT，并具有出色的重現(xiàn)性（24個(gè)泳道: pAKT < 10% CVs和Total AKT < 5% CVs）。? 微量樣品，3小時(shí)獲得結(jié)果，定量準(zhǔn)，重復(fù)性高；圖注：StellarTM 熒光檢測(cè)的靈敏度通過(guò)DNA與檢測(cè)抗體相連的多個(gè)信號(hào)放大步驟實(shí)現(xiàn)。? 簡(jiǎn)單高效對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路研究中磷酸化蛋白進(jìn)行檢測(cè)? 全程追蹤記錄，原始數(shù)據(jù)不可纂改，解決傳統(tǒng) WB 圖片誤用造假問題? 總蛋白質(zhì)含量歸一化分析，可以比較蛋白質(zhì)上樣量? 與對(duì)照樣品歸一化處理，比使用內(nèi)參蛋白更可靠，增加數(shù)據(jù)說(shuō)服力[1]. Back S., Necarsulme J., Whitaker L.R., et al., Neuron-Specifific Genome Modifification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats. Neuron , 2019, 102: 105–119.[2]. Ilyas Chachoua, Ilias Tzelepis, Hao Dai, et al., Canonical WNT signaling-dependent gating of MYC requires a noncanonical CTCF function at a distal binding site. NATURE COMMUNICATIONS, 2022,13: 204.[3]. 雷虹, 胡峰瑞, 陳妍珂, 茍興春. 蛋白免疫印跡和全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量分析的比較研究[J]. 生物醫(yī)學(xué), 2021, 11(2): 113-119.
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