近年來(lái)，以單分子分辨率研究個(gè)體DNA的技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了我們對(duì)人類基因組、微生物組和疾病遺傳基礎(chǔ)的了解。有了如此詳細(xì)的DNA視圖，我們能夠觀察到以往無(wú)法檢測(cè)的基因變異和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。
然而，如今單分子分析的標(biāo)準(zhǔn)方法至少需要1-5 μg起始DNA。這意味著研究人員無(wú)法在樣本量有限的情況下使用這些工具，比如液體活檢（只有數(shù)千個(gè)細(xì)胞），這限制了這些技術(shù)的科研和臨床潛力。
近日，格拉斯通研究所（Gladstone Institutes）的研究人員開發(fā)出兩種新的單分子分析工具，可將所需樣本量減少90%到95%。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Nature Genetics》雜志上，展示了這些工具如何幫助科學(xué)家們解決以前無(wú)法回答的生物學(xué)問題。
對(duì)DNA進(jìn)行片段化+標(biāo)記
第一種新工具被稱為SMRT-Tag（基于轉(zhuǎn)座酶片段化的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序）。它能夠確定長(zhǎng)片段DNA中的堿基序列，并繪制甲基基團(tuán)的位置。甲基基團(tuán)在基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，對(duì)了解疾病至關(guān)重要，因此研究人員想了解它們?cè)贒NA上的配置。
共同通訊作者、格拉斯通研究所的助理研究員Vijay Ramani博士表示：“當(dāng)我們只有很少的DNA時(shí)，我們不能復(fù)制更多的拷貝，并使用我們以往的實(shí)驗(yàn)方案。復(fù)制DNA會(huì)導(dǎo)致甲基化模式丟失，并引入其他錯(cuò)誤。”
相反，他的團(tuán)隊(duì)采用了一種名為“轉(zhuǎn)座酶片段化（tagmentation）”的方法，這種方法利用細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座酶，將DNA分子切割成更容易處理的片段，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步分析所需的化學(xué)成分進(jìn)行標(biāo)記。
研究人員面臨的挑戰(zhàn)是，如何利用轉(zhuǎn)座酶片段化的化學(xué)試劑將少量的DNA打斷成3 kb-5 kb的長(zhǎng)片段。他們的方法使用發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)“標(biāo)記”每個(gè)片段的末端，形成DNA長(zhǎng)環(huán)，以便測(cè)序儀可靠讀取。
“我們實(shí)驗(yàn)室的師生們付出了巨大的努力，” Ramani談道。“我們必須測(cè)試不同版本的Tn5以及近100種不同的條件，包括緩沖液、酶和溫度。當(dāng)你處理少量的DNA時(shí)，任何導(dǎo)致DNA丟失的操作都會(huì)讓事情變得更加棘手。”
獲得可行動(dòng)的數(shù)據(jù)
對(duì)SMRT-Tag進(jìn)行優(yōu)化后，研究團(tuán)隊(duì)證明了它的表現(xiàn)與現(xiàn)有的方案一樣出色，但DNA使用量要少得多——大約只需要40 ng DNA，相當(dāng)于7 x 104個(gè)細(xì)胞。
“使用PacBio的單分子測(cè)序儀，從來(lái)沒有人對(duì)如此少量的DNA進(jìn)行測(cè)序，并達(dá)到我們目前的覆蓋度，” Ramani談道。
接下來(lái)，研究人員將SMRT-Tag與他們之前開發(fā)的一種名為SAMOSA的方法相結(jié)合，SAMOSA代表了“單分子腺嘌呤甲基化寡核苷酸測(cè)序分析”，它能夠揭示甲基化模式，這些模式反映了染色質(zhì)可及性。
現(xiàn)在，有了這種新的SAMOSA-Tag工具，他們能夠用少量的DNA來(lái)評(píng)估染色質(zhì)可及性。為了證明這一點(diǎn)，他們將其應(yīng)用于移植到小鼠體內(nèi)的前列腺癌細(xì)胞上。這種方法揭示了原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間的染色質(zhì)可及性差異，暗示了癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。
共同領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)研究的Siva Kasinathan博士稱：“這只是一個(gè)例子，說明我們的工具可以應(yīng)用在癌癥及其他疾病的臨床相關(guān)樣本上，因?yàn)樵谶@些情景下，DNA是短缺的。我們認(rèn)為有一些容易獲得的成果，可以解鎖新的生物學(xué)知識(shí)，這對(duì)幫助今后的患者很重要。”
（文章來(lái)源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240604215835729.htm） | 
