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數(shù)字PCR儀在動防系統(tǒng)的應(yīng)用
[ 發(fā)布日期:2023-10-10 8:54:12    閱讀次數(shù):1872 ]
 一、數(shù)字PCR技術(shù)簡述

數(shù)字PCR技術(shù)(digital polymerase chain reaction,dRCR)有別于實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time Quantitative PCR,qPCR)。dRCR是第三代PCR技術(shù),無需標準曲線,即可對不同生物樣本類型中獲得的DNA/RNA進行更精確、更靈敏的絕對定量檢測。

dRCR的原理及流程比較簡單,以目前主流的納米微孔芯片式dRCR儀為例:

1.配液:加入引物、探針、模板、Master Mix、水配制PCR反應(yīng)體系;

2.分區(qū):將PCR反應(yīng)體系加入納米微孔芯片,芯片通常有20000個以上的納米微孔,反應(yīng)體系分配到各個納米微孔之中,形成獨立的反應(yīng)單元;

3.擴增:隨機分配的目標DNA/RNA分子在每個納米微孔中進行單獨、平行的PCR反應(yīng);

4.檢測:擴增結(jié)束后檢測各個納米微孔的熒光信號;

5.計算:理論上,樣本充分稀釋時,每個納米微孔包含少于或等于一個拷貝的目標DNA/RNA分子。但實際上,部分納米微孔可能含有多個DNA/RNA分子,因此在計數(shù)陰性、陽性納米微孔后,需要應(yīng)用泊松分布進行校正,才能得到目標DNA/RNA分子的拷貝數(shù)或濃度。




圖1 dRCR的實驗流程



圖2 dRCR的泊松分布校正


與第一、二代PCR技術(shù)相比,dRCR具有很多優(yōu)勢:一是特異性、靈敏性均有顯著提高;二是在不依賴內(nèi)參和標準曲線的前提下,可直接得到絕對量化指標;三是納米微孔反應(yīng)單元相互獨立、封閉,避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產(chǎn)物間的相互干擾,極大的提高了檢測的準確度和可重復性。

二、dRCR在動物疫病防控中的應(yīng)用

1.核酸標準品定量

核酸標準品是一種已知濃度和純度的核酸分子,可以用于核酸定量、質(zhì)量控制和實驗標準化等方面,是分子生物學和生物技術(shù)研究中非常重要的實驗材料。使用分光光度法測量核酸標準品濃度,容易受到污染核酸或蛋白質(zhì)和鹽的影響,核酸標準品為質(zhì)粒時,儲備液的不均勻性或存在沒有靶序列插入的質(zhì)粒,同樣影響標準品定量的準確性。

dPCR技術(shù)在核酸標準品定量方面的優(yōu)勢在于其高精度和高可靠性。dPCR技術(shù)可以準確地計算目標序列的拷貝數(shù),避免了實時熒光定量PCR技術(shù)中的測量誤差和擴增效率誤差。因此,dPCR技術(shù)可以提供非常精確的核酸標準品定量結(jié)果。

2.動物疫病檢測

dPCR技術(shù)在動物疫病檢測方面的有廣泛的應(yīng)用前景,可以檢測各種動物疫病的病原體,例如禽流感、口蹄疫、豬瘟等,其優(yōu)勢在于其高靈敏度、高特異性和高可靠性。dPCR技術(shù)可以檢測樣品中非常低濃度的病原核酸,靈敏度相對于qPCR通常高5-100倍,因此可以在早期發(fā)現(xiàn)病例,從而避免疾病的擴散和傳播。

圖3 qPCR梯度檢測:10拷貝以下樣本無法檢出


圖4 dPCR梯度檢測:有效檢出10拷貝以下樣本


3.動物疫病多重檢測

多重PCR技術(shù)一次擴增反應(yīng)即可實現(xiàn)對多種病原體進行檢測,相較單重檢測而言成本顯著降低。但是仍然存在許多影響多重PCR擴增與檢測效果的因素,其中多個靶標擴增效率的一致性是最大的難題,檢測重數(shù)越多,效率一致性往往越低。dRCR采用終點熒光檢測和納米微孔分區(qū)技術(shù),檢測結(jié)果不受擴增效率的影響,能準確定量和避免漏檢。

目前主流品牌的dRCR儀均有多個檢測通道,如羅氏診斷的Digital LightCycler數(shù)字PCR儀擁有6個檢測通道,可實現(xiàn)6重病原檢測。下圖應(yīng)用羅氏dRCR儀同時檢測禽流感H5、H7、H9亞型和新城疫病毒4個病原,各檢測通道間無干擾,定量結(jié)果準確性高。

圖5 羅氏Digital LightCycler數(shù)字PCR儀多重檢測

4.抗原快速診斷產(chǎn)品的評價

來源不同廠家的抗原快檢試劑,靈敏度差異較大。dPCR可以絕對定量待測樣品中的病原核酸,從而精準的評價抗原檢測試劑的檢測限。

5.動物疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

dPCR可對重組腺病毒疫苗等活載體疫苗進行定量,作為生產(chǎn)過程中質(zhì)量評價、活性滴定、雜質(zhì)評估的有力工具。同時,dPCR可定量動物血液中微量的病毒,可作為疫苗免疫效果評價的有效工具。

6.動物源性成分檢測

世界各國每年都會有許多肉類摻假事件被曝光,包括將廉價肉摻入高價肉或添加非肉成分冒充肉及肉制品等。dPCR技術(shù)可直接對物種特異性DNA的拷貝數(shù)進行絕對定量,只需構(gòu)建物種特異性DNA拷貝數(shù)與肉粉重量之間的關(guān)系曲線,即可對肉制品含量進行定量。

三、納米微孔芯片數(shù)字PCR儀新貴

Digital LightCycler數(shù)字PCR儀是羅氏最新推出的高性能產(chǎn)品,充分拓展數(shù)字PCR的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖6羅氏Digital LightCycler 數(shù)字PCR儀

羅氏Digital LightCycler亮點

1.應(yīng)用靈活:陣列式納米芯片技術(shù),3種密度芯片可更換;

2.多重檢測:6 重熒光多色檢測,便于開發(fā)更多的應(yīng)用;

3.高度自動化:分析系統(tǒng)整合PCR反應(yīng)、芯片檢測功能;

4.通量高單次檢測 8-96個樣本,適合科研及臨床檢測;

5.時間快:單塊板1.5h, 八塊板滿載則 4h 內(nèi)完成樣品擴增、分析;

6.5x預混液: 更大的樣品量輸入;

四、結(jié)語

dPCR以明顯的技術(shù)優(yōu)勢,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸檢測的方方面面。dRCR在病原微生物檢測,腫瘤液態(tài)活檢,遺傳生殖檢測,公共衛(wèi)生檢測,環(huán)境微生物檢測,RNA表達檢測,NGS文庫定量,甲基化檢測等領(lǐng)域都發(fā)揮著越發(fā)重要的作用。通過建立完善的dPCR檢測流程,相信dPCR能讓蓬勃發(fā)展的分子診斷如虎添翼。


 
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