近日，清華大學(xué)藥學(xué)院儲凌課題組在《Journal of the American Chemical Society》發(fā)表了題為“Self-Renewable Tag for Photostable Fluorescence Imaging of Proteins”的文章，報道了一種用于蛋白質(zhì)光穩(wěn)定熒光成像的熒光自修復(fù)蛋白標(biāo)簽（srTAG），該工作作為活細(xì)胞蛋白熒光標(biāo)記方法的強有力補充，能夠極大助力細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸分布等相關(guān)生物問題的研究。
研究背景
隨著蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，活細(xì)胞熒光成像已成為研究蛋白質(zhì)功能和定位的常規(guī)工具。而小分子染料的興起和利用熒光團(tuán)的位點特異性結(jié)合的自標(biāo)記標(biāo)簽的開發(fā)擴大了熒光成像工具箱。與廣泛采用的熒光蛋白相比，自我標(biāo)記蛋白(如HaloTag、SNAP-Tag)提供了更靈活的染料光譜特性選擇、更高的亮度和光穩(wěn)定性。然而，在熒光成像實驗中，光漂白在一定程度上限制了空間和時間分辨率以及成像持續(xù)時間。
為了實現(xiàn)細(xì)胞器的長時間、多色顯微成像，Schepartz和Toomre實驗室報告了一系列高密度環(huán)境敏感（HIDE）探針，能夠識別質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體、高爾基體，并且比相同的熒光團(tuán)連接到細(xì)胞器駐留時間長15-40倍。HIDE探針利用脂質(zhì)膜的親脂性環(huán)境將羅丹明兩性離子/螺環(huán)平衡轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒饴莪h(huán)形式，“隱藏”這一熒光團(tuán)池以避免光漂白，從而實現(xiàn)長時間超分辨率成像。盡管HIDE探針在某些情況下有用，但它依賴于靶向小分子的細(xì)胞器，因此不能推廣用于標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)（圖1）。最近，HaloTag7的可逆熒光標(biāo)記被報道。這些可逆的HaloTags（即xHTLs和reHaloTag）在不同超分辨率顯微長時程成像實驗中表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。因此，迫切需要發(fā)展一種用于長時間同時對多種蛋白質(zhì)成像的互補方法。
研究過程與成果
清華大學(xué)藥學(xué)院儲凌課題組探索了HIDE探針的概念和可逆交換標(biāo)記策略是否可以結(jié)合起來開發(fā)用于蛋白質(zhì)長時間成像的自標(biāo)記標(biāo)簽。AP1867是Ariad Pharmaceuticals開發(fā)的一種小分子，它能選擇性的與野生型FKBP12上的 FK506結(jié)合蛋白（FKBP）F36V突變體結(jié)合。在本工作中通過將熒光染料JF635與AP1867偶聯(lián)來合成ZCD-1，并在瞬時表達(dá)FKBPF36V-mEmerald NLS的U2OS細(xì)胞進(jìn)行FRAP實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光信號能夠恢復(fù)到初始熒光強度的65%。在初步結(jié)果的鼓舞下，又通過評估不同彈頭、不同連接體、不同氨基酸突變對共聚焦成像質(zhì)量和熒光恢復(fù)來優(yōu)化標(biāo)簽, 發(fā)現(xiàn)了srTAG (self-renewable Tag) FKBPF36L/ZCD-1。
與目前常用的自標(biāo)記標(biāo)簽相比，srTAG表現(xiàn)出明顯的熒光恢復(fù)，并給與三次光漂白刺激后能夠恢復(fù)到原有激光強度的65%。為了驗證srTAG在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)方面的廣泛適用性，在表達(dá)FKBPF36L與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）標(biāo)記蛋白Sec61β, 線粒體嵴膜蛋白COX8A、線粒體外膜蛋白TOMM20和溶酶體膜蛋白LAMP1融合的活U2OS細(xì)胞進(jìn)行了共聚焦成像。所有成像的蛋白質(zhì)都給出了預(yù)期的分布模式。
為了闡明srTAG在超分辨率成像中的作用，作者在表達(dá)Lifeact-FKBPF36L和融合Sec61 b的U2OS細(xì)胞中進(jìn)行了活細(xì)胞STED成像，結(jié)果顯示srTAG能夠用于超分辨成像，并且能夠?qū)⒎直媛蕪墓簿劢沟?00nm左右提升到70nm左右。與HaloTag相比，srTAG在超分辨STED成像中表現(xiàn)出更好的光穩(wěn)定性。除此之外，srTAG能夠與可逆標(biāo)簽reHaloTag兼容進(jìn)行雙色成像。
細(xì)胞核內(nèi)的m6A識別蛋白YTHDC1會發(fā)生液-液相分離，在活細(xì)胞中以核點狀分布。作者將YTHDC1與不同的標(biāo)簽融合，以檢查標(biāo)簽大小是否會影響YTHDC1的分布。表達(dá)EGFP、FlAsH或FKBPF36L融合的YTHDC1的U2OS細(xì)胞表現(xiàn)為核點狀。然而，Halo-YTHDC1的熒光信號在整個細(xì)胞核中擴散。
在該項工作的最后，作者猜測熒光信號的恢復(fù)可能是由于熒光團(tuán)在蛋白質(zhì)上的“開/關(guān)”平衡或非共價探針的可交換性。為了闡明其機制，首先純化了重組FKBPF36L蛋白，并將FKBPF36L/ZCD-1復(fù)合物固定在蓋玻片上。FRAP實驗通過全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果顯示在沒有自由擴散的ZCD-1的情況下觀察到熒光的恢復(fù)，證實熒光團(tuán)“在蛋白質(zhì)上”的平衡有助于熒光的恢復(fù)。作為對照，純化的Halo/JF635-CA復(fù)合物在光漂白后沒有恢復(fù)熒光信號。另一方面，為了研究探針交換是否也有助于FRAP現(xiàn)象，首先用ZCD-1孵育表達(dá)NLS-FKBPF36L的U2OS細(xì)胞，然后替換為含有ZCD-7的培養(yǎng)基。結(jié)果顯示在532nm通道中出現(xiàn)熒光信號和在633nm通道中信號減弱，表明ZCD-1探針被ZCD-7交換。
研究意義
該課題組開發(fā)了一種用于蛋白質(zhì)光穩(wěn)定熒光成像的熒光自修復(fù)蛋白標(biāo)簽（srTAG）。利用了熒光兩性離子和非熒光螺環(huán)形式之間的“蛋白質(zhì)上”熒光團(tuán)平衡，以及非共價探針的可交換性。該工作發(fā)現(xiàn)srTAG在光漂白后自發(fā)恢復(fù)熒光信號，與具有相同熒光團(tuán)的Halo和SNAP-tag綴合物相比，漂白半衰期延長2到6倍。除此之外，srTAG概念適用于不同吸收和發(fā)射光譜的熒光團(tuán)。srTAG能夠與STED顯微成像兼容，可以與其他可交換標(biāo)簽組合進(jìn)行多色成像實驗。此外，與其他自標(biāo)記標(biāo)簽或熒光蛋白相比，srTAG的尺寸較?。?2kDa），對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)運輸和分布影響相對較小。因此，這項工作作為可逆標(biāo)記標(biāo)簽的強有力補充，能夠極大助力研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸分布等相關(guān)的生物應(yīng)用。
該項工作得到了國家重點研發(fā)計劃（No.2021YFA0910900）、國家青年人才計劃和清華大學(xué)啟動基金的資助。清華大學(xué)生命科學(xué)院，北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的陳春來教授和清華大學(xué)IDG/麥戈文腦研究所，清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心吝易教授在機制和應(yīng)用方面提供了大量的幫助。
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