一、數(shù)字PCR原理及優(yōu)勢(shì)
數(shù)字 PCR（dPCR）是一種用于定量 DNA 或 RNA 靶標(biāo)的基于PCR的新興技術(shù)。該方法建立在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增和基于熒光探針的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，以單分子分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的精確、絕對(duì)定量。
其樣本制備步驟與實(shí)時(shí)（RT）PCR 的步驟相似。將含有靶標(biāo)序列、引物、探針和其他試劑的反應(yīng)混合物隨機(jī)分配到成千上萬個(gè)通常具有相同體積的分區(qū)中，以使每個(gè)分區(qū)含有靶含 0、1或幾個(gè)靶標(biāo)分子。使用熒光探針通過終點(diǎn)法來檢測(cè)擴(kuò)增的靶標(biāo)，以便從所有分區(qū)中分別獲得單獨(dú)的熒光亮度值。
圖1：分區(qū)和擴(kuò)增后dPCR納米孔芯片的圖像。
在終點(diǎn)檢測(cè)時(shí)，包含擴(kuò)增的熒光靶標(biāo)分子的分區(qū)被視為陽性分區(qū)，而包含很少或沒有熒光且沒有任何擴(kuò)增的靶標(biāo)分子的分區(qū)被視為陰性分區(qū)。對(duì)于每次反應(yīng)，陽性分區(qū)可能含有一個(gè)以上靶標(biāo)分子，陰性分區(qū)的比例為使用泊松統(tǒng)計(jì)對(duì)包含靶擴(kuò)增序列的分子數(shù)量進(jìn)行定量提供了基礎(chǔ)。
與定量PCR（qPCR）相比，dPCR可實(shí)現(xiàn)更高的精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度，因?yàn)镻CR抑制劑的干擾和競(jìng)爭(zhēng)性背景DNA會(huì)因反應(yīng)混合物的分區(qū)而減少。與 qPCR 相比，dPCR 的主要優(yōu)勢(shì)包括：
• 無需標(biāo)準(zhǔn)曲線
dPCR定量更準(zhǔn)確，因?yàn)樗蕾囉趯⒎謪^(qū)聚類為陰性和陽性組，然后直接計(jì)數(shù)陰性分區(qū)并計(jì)算目標(biāo)濃度，而無需運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。這消除了擴(kuò)增效率變化影響靶標(biāo)定量的可能性。
•信噪比增加
相對(duì)于潛在PCR抑制劑和干擾背景序列，分區(qū)有效富集了靶標(biāo)陽性分區(qū)中的靶標(biāo)濃度，從而可以更靈敏地檢測(cè)罕見靶標(biāo)。
圖2：通過分區(qū)顯示靶序列（橙色）富集相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性背景序列（藍(lán)色）的圖示。在未分區(qū)樣本中（左側(cè)試管），靶序列與背景序列的比例為 1:8。在靶標(biāo)陽性分區(qū)（右邊的圓圈）中，比例從1:1至無窮大（純靶標(biāo)）不等。
• 更高的精密度
分區(qū)還可以提高靶標(biāo)定量的精密度。分區(qū)越多，精密度越高。合并多個(gè)泳道可以進(jìn)一步提高精密度。
二、數(shù)字PCR儀分類
數(shù)字PCR儀按照其原理分為油包水液滴式和微孔芯片式，其中微孔芯片式技術(shù)較為先進(jìn)。羅氏公司Digital LightCycler數(shù)字PCR儀是最新推出的高性能產(chǎn)品，充分拓展數(shù)字PCR的應(yīng)用領(lǐng)域。
圖3.羅氏Digital LightCycler 數(shù)字PCR儀
羅氏Digital LightCycler優(yōu)勢(shì)
1. 應(yīng)用靈活：納米微孔芯片技術(shù)，3種密度芯片可更換，滿足不同應(yīng)用場(chǎng)景；
2. 多重檢測(cè)：6重?zé)晒舛嗌珯z測(cè)，便于開發(fā)更多的應(yīng)用；
3. 高度自動(dòng)化：分析系統(tǒng)整合PCR反應(yīng)、芯片檢測(cè)功能，操作簡(jiǎn)單；
4. 通量高：?jiǎn)未螜z測(cè)8-96個(gè)樣本，兼顧靈活性與高通量；
5. 時(shí)間快：?jiǎn)螇K板1.5h, 12塊板4h內(nèi)完成樣品擴(kuò)增、分析；
6. 5倍濃度預(yù)混液：可加入更大的樣品量，提交檢測(cè)靈敏度；
三、多病原檢測(cè)應(yīng)用
大多數(shù)dPCR用戶仍然使用具有兩個(gè)光學(xué)通道的平臺(tái)，并依賴于復(fù)雜的方法（例如，滴定和混合不同標(biāo)記的探針）進(jìn)行多重檢測(cè)。這些方法需要大量的檢測(cè)設(shè)計(jì)專業(yè)知識(shí)、耗時(shí)的優(yōu)化過程、由經(jīng)驗(yàn)豐富的用戶手動(dòng)聚類，并且有時(shí)會(huì)生成難以解讀的結(jié)果。羅氏Digital LightCycler數(shù)字PCR儀的6通道檢測(cè)系統(tǒng)，通過將每個(gè)靶標(biāo)分配至其自己的光學(xué)通道，大大簡(jiǎn)化了多重檢測(cè)。多重檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)包括：在一次反應(yīng)中可檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)靶標(biāo)；可選通道檢測(cè)額外的質(zhì)控品或參比品；可減少樣本體積要求。
下圖應(yīng)用羅氏dRCR儀同時(shí)檢測(cè)禽流感H1、H3、H5、H7、H9亞型和通用型6個(gè)病原，各檢測(cè)通道間無干擾，定量結(jié)果準(zhǔn)確性高。
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通道
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染料
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目標(biāo)基因
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1
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Atto425
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禽流感H1
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2
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FAM
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禽流感H3
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3
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HEX
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禽流感H5
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4
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Texas Red
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禽流感H7
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5
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Cy5
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禽流感H9
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6
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Cy5.5
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禽流感通用型
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表1：6重檢測(cè)的目標(biāo)靶標(biāo)的通道分配。
圖4.多重病原檢測(cè)散點(diǎn)圖
多重PCR技術(shù)一次擴(kuò)增反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)，相較單重檢測(cè)而言成本顯著降低。羅氏dRCR采用終點(diǎn)熒光檢測(cè)和納米微孔分區(qū)技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果不受擴(kuò)增效率的影響，能準(zhǔn)確定量和避免漏檢。 | 
