(波士頓)自20世紀(jì)50年代以來(lái)，研究人員一直使用華萊士·庫(kù)爾特發(fā)明的著名方法“流式細(xì)胞術(shù)”來(lái)表征研究和人類個(gè)體血液樣本中不同類型的免疫細(xì)胞。這使得人們對(duì)免疫細(xì)胞的發(fā)育有了更深入的了解，也為評(píng)估人類健康和診斷各種血癌提供了新的方法。后來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)也應(yīng)用于其他細(xì)胞類型。
在傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)中，用與熒光探針相連的抗體分子檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。然而，在提供單細(xì)胞靈敏度的同時(shí)，這種方法在檢測(cè)多種蛋白質(zhì)時(shí)受到熒光團(tuán)數(shù)量的限制，這些熒光團(tuán)可以在整個(gè)熒光燈光譜中清楚地區(qū)分。2009年，“大規(guī)模細(xì)胞術(shù)”的出現(xiàn)，使人們能夠同時(shí)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的50種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，并對(duì)細(xì)胞的特性和生理狀態(tài)進(jìn)行更細(xì)致的分析。在大規(guī)模細(xì)胞術(shù)中，抗體與金屬元素的非放射性同位素相關(guān)聯(lián)。這些同位素可以根據(jù)它們的質(zhì)量在質(zhì)量細(xì)胞儀的不同通道中進(jìn)行量化。然而，與流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡相比，質(zhì)量細(xì)胞術(shù)及其同類“圖像質(zhì)量細(xì)胞術(shù)”(IMC)用于在完整組織切片中可視化細(xì)胞蛋白，其代價(jià)是靈敏度降低。
現(xiàn)在，又過(guò)了15年，由哈佛大學(xué)Wyss研究所領(lǐng)導(dǎo)的一項(xiàng)研究合作，包括麻省理工學(xué)院和多倫多大學(xué)的研究人員，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種利用DNA納米技術(shù)顯著提高細(xì)胞計(jì)數(shù)和IMC靈敏度的方法。將一種名為“循環(huán)延伸放大”(amplification by Cyclic Extension, ACE)的新型信號(hào)放大技術(shù)應(yīng)用于與抗體相關(guān)的DNA條形碼，他們能夠?qū)⒖贵w結(jié)合金屬同位素產(chǎn)生的蛋白質(zhì)信號(hào)放大500倍以上，并同時(shí)以高靈敏度檢測(cè)30多種不同的蛋白質(zhì)。這種新方法使他們能夠定量檢測(cè)稀有蛋白質(zhì)，研究復(fù)雜的生物組織變化，并研究調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的相互連接的蛋白質(zhì)的整個(gè)網(wǎng)絡(luò)如何對(duì)刺激和病理?xiàng)l件作出反應(yīng)。應(yīng)用于IMC, ACE還可以在組織學(xué)切片上識(shí)別細(xì)胞類型和組織區(qū)室，以及與多囊腎病病理相關(guān)的組織變化。研究結(jié)果發(fā)表在《自然生物技術(shù)》雜志上。
“ACE有助于縮小細(xì)胞分析的關(guān)鍵差距:通過(guò)提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的靈敏度，它使單細(xì)胞分析平臺(tái)同時(shí)實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高復(fù)用和高吞吐量。它為研究懸浮液中的單細(xì)胞和完整組織提供了高度多路和敏感的方法，可以更深入地了解正常和病理生物過(guò)程，”領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)研究的Wyss研究所核心教師彭銀博士說(shuō)。Yin也是哈佛醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物系的教授。
更多的DNA，更多的金屬同位素，更高的靈敏度
此前，Yin和他在Wyss研究所的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種dna成像技術(shù)，可以在單分子水平上以超高分辨率揭示細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)作，或者通過(guò)在單個(gè)組織切片中可視化許多不同的RNA和蛋白質(zhì)分子。但是用這些方法產(chǎn)生的DNA結(jié)構(gòu)沒(méi)有足夠的彈性來(lái)承受細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)中使用的相對(duì)惡劣的條件。
“與傳統(tǒng)的大規(guī)模細(xì)胞術(shù)相比，ACE允許研究人員將抗體分子與大量增加的金屬同位素相關(guān)聯(lián)，從而解決了目前大規(guī)模細(xì)胞術(shù)的敏感性問(wèn)題。這極大地促進(jìn)了廣泛的低豐度蛋白質(zhì)的量化，使用以前的單細(xì)胞方法一直具有挑戰(zhàn)性，”共同第一作者、尹氏小組的博士后倫曉康博士說(shuō)。倫與共同第一作者盛寬偉博士合作完成了該項(xiàng)目，盛寬偉博士最初開(kāi)發(fā)了ACE用于其他應(yīng)用，包括多路復(fù)用成像，他也是尹的博士后研究員。盛說(shuō):“受到我們之前在引物延伸反應(yīng)上的工作的啟發(fā)，該反應(yīng)可以創(chuàng)建線性DNA串聯(lián)體(同一DNA序列的多個(gè)拷貝串聯(lián)在一起)，以及通過(guò)同步熱循環(huán)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，我們發(fā)明了ACE，通過(guò)可控的熱循環(huán)在原位合成線性串聯(lián)體。”
ACE為攜帶短金屬同位素的“檢測(cè)鏈”創(chuàng)建了一個(gè)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的支架。此外，通過(guò)支架鏈的分支合成，研究人員可以進(jìn)一步提高該方法檢測(cè)稀有蛋白質(zhì)的靈敏度。線性ACE平均提供13倍的信號(hào)放大，而分支ACE允許最初未放大的信號(hào)增加500倍以上。為了穩(wěn)定整個(gè)ACE序列復(fù)合物，并在質(zhì)量細(xì)胞分析中保持其完整，他們用化學(xué)交聯(lián)劑將支架和添加的檢測(cè)鏈之間形成的短雙鏈交聯(lián)。“按照這個(gè)配方，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)包含33個(gè)可區(qū)分的(同源)ACE序列的面板，這些序列的合成不會(huì)相互干擾，并將其應(yīng)用于三種完全不同類型的分析，”Sheng說(shuō)，他也是Yin團(tuán)隊(duì)的博士后研究員。
工作中的ACE
研究小組首先利用ACE研究了上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞和再向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMTs)和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(METs)發(fā)生在胚胎發(fā)育過(guò)程中，但當(dāng)腫瘤發(fā)生侵襲性和轉(zhuǎn)移性時(shí)，前者也會(huì)重新發(fā)生。通過(guò)分析單個(gè)小鼠乳腺癌細(xì)胞在28天內(nèi)從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞再到間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程中的32種上皮和間充質(zhì)標(biāo)記物、信號(hào)分子和罕見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，他們能夠?qū)@兩個(gè)過(guò)程有新的了解。“ACE使我們能夠同時(shí)分析低豐度轉(zhuǎn)錄因子水平與反映細(xì)胞生理和單細(xì)胞信號(hào)狀態(tài)的標(biāo)記。這使得我們對(duì)EMT和MET中的分子程序是如何由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(包括Zeb-1和Snail/Slug)的增加和減少所驅(qū)動(dòng)的有了更詳細(xì)的了解。”
在他們的第二個(gè)例子中，他們放大到單個(gè)T細(xì)胞的內(nèi)部工作。刺激其表面的t細(xì)胞受體(TCR)分子導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的激活。由于T細(xì)胞體積小，在單細(xì)胞分辨率上分析這些信號(hào)反應(yīng)一直很困難。這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的單個(gè)蛋白質(zhì)被磷酸殘基激活，磷酸殘基被其他通常稱為激酶的網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)附著在它們上面。這些被激活的網(wǎng)絡(luò)蛋白中的許多繼續(xù)磷酸化網(wǎng)絡(luò)中的其他蛋白。這最終會(huì)導(dǎo)致t細(xì)胞行為的改變，例如對(duì)病原體或癌細(xì)胞的行為。研究人員將ACE應(yīng)用于一組30種抗體，這些抗體與應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞增殖和其他反應(yīng)中具有功能的tcr網(wǎng)絡(luò)蛋白中的磷酸化基元特異性結(jié)合。“使用ace增強(qiáng)的質(zhì)量細(xì)胞分析，我們捕獲了個(gè)體原代人T細(xì)胞中動(dòng)態(tài)變化的TCR網(wǎng)絡(luò)的定量快照。這使我們能夠研究特定t細(xì)胞激活事件的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的單細(xì)胞變化，并揭示細(xì)胞外信號(hào)如何從基態(tài)激活網(wǎng)絡(luò)”。
研究小組使用同樣的ace增強(qiáng)抗體小組來(lái)研究一種被稱為“損傷性t細(xì)胞麻痹”的現(xiàn)象。T細(xì)胞在其環(huán)境中受到損傷，例如在重大外科手術(shù)中引起的組織損傷，通常會(huì)產(chǎn)生免疫抑制。為了開(kāi)始了解TCR網(wǎng)絡(luò)是如何導(dǎo)致這種情況的，Yin的小組與合著者M(jìn)ichael Yaffe醫(yī)學(xué)博士合作，Michael Yaffe是麻省理工學(xué)院David H. Koch科學(xué)教授和生物學(xué)和生物工程教授，他對(duì)組織損傷部位周圍的微環(huán)境如何抑制免疫系統(tǒng)有濃厚的興趣。Yaffe向研究小組提供了從接受手術(shù)的患者身上獲得的“術(shù)后引流液”(POF)樣本。用POFs和tcr刺激T細(xì)胞，使研究人員能夠分離出導(dǎo)致單個(gè)T細(xì)胞停止分裂并耗盡的不同網(wǎng)絡(luò)變化。
最后，他們研究了ACE在利用IMC對(duì)人體腎臟組織切片進(jìn)行蛋白質(zhì)空間分析方面的應(yīng)用。由于腎臟組織本身具有很強(qiáng)的熒光性，因此熒光顯微鏡很難對(duì)其進(jìn)行分析，而傳統(tǒng)的IMC則缺乏靈敏度。研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)由20種ace增強(qiáng)抗體組成的小組，用于各種腎臟標(biāo)志物，并用它來(lái)檢查來(lái)自多囊腎病患者的腎皮質(zhì)切片。他們與合著者、加拿大多倫多大學(xué)教授、多路成像專家Hartland Jackson博士合作采用了這種方法，使他們能夠識(shí)別腎臟近端和遠(yuǎn)端小管、收集管和血液過(guò)濾腎小球內(nèi)不同的細(xì)胞類型及其組織。倫說(shuō):“我們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞和組織組織的新的疾病特異性特征，并發(fā)現(xiàn)與腎臟疾病相關(guān)的干細(xì)胞標(biāo)記物巢蛋白在腎小球中的表達(dá)非常不均勻。”“這可能意味著組織的不同部分可能同時(shí)經(jīng)歷不同的病理階段。”
“彭銀的團(tuán)隊(duì)和他們的合作者開(kāi)發(fā)的這種新的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法再次顯示了利用DNA納米技術(shù)來(lái)增強(qiáng)與臨床護(hù)理高度相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的力量，并使其具有更高的靈敏度和特異性。“這種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法將導(dǎo)致對(duì)健康和疾病期間細(xì)胞，組織和器官功能的全新見(jiàn)解，”共同資深作者和Wyss創(chuàng)始董事Donald Ingber醫(yī)學(xué)博士說(shuō)。
（文章來(lái)源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-7/20240730235514992.htm） | 
